Deutsche Muskelstiftung

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Forschungsschwerpunkte AG Wirth, Uniklinik Köln - Institut für Humangenetik

Forschungsschwerpunkte

A. Molekulargenetik und -biologie der spinalen Muskelatrophie (5q13)

  1. Molekularbiologische und funktionelle Untersuchung der survival motor neuron (SMN)-Gene und der SMN-interagierenden Proteine bei der autosomal rezessiven spinalen Muskelatrophie
  2. Aufklärung des alternativen Spleißweges von SMN2
  3. Entwicklung eines therapeutischen Ansatzes für SMA-Patienten basierend auf der Aktivierung des SMN2-Gens.
  4. Suche nach SMA-modifizierenden Faktoren

Ergebnisse und Ziele

SMA wird durch homozygote Mutationen im SMN1-Gen (5q13) verursacht

Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist die zweithäufigste rezessive Erbkrankheit und die häufigste Todesursache im Kindesalter. Die SMA wird in ca. 96% durch homozygote Deletionen/Mutationen des survival motor neuron Gens (SMN1) verursacht. Der Verlust des SMN1-Genproduktes führt zur Zerstörung der alpha-Motoneuronen im Rückenmark, wodurch es sekundär zur Muskelschwäche und Atrophie der proximalen Arm- und Beinmuskulatur und später der gesamten Rumpfmuskulatur kommt.  

SMN2 wird durch eine einzige stille Mutation im Exon 7 alternativ gespleißt

Eine zweite, fast identische Kopie, SMN2, unterscheidet sich im kodierenden Bereich durch lediglich ein Nukleotid von SMN1, wobei der Austausch keine Aminosäureveränderung hervorruft. Der homozygote Verlust von SMN2 führt nicht zu einem klinischen Phänotyp. Daher muss man sich fragen, warum homozygote Deletionen des SMN1-Gens, nicht jedoch des SMN2-Gens, SMA verursachen? Wir konnten zeigen, dass die Transition C zu T im Codon 280 (Exon 7) zur Zerstörung eines exonischen Spleißverstärkers (exonic splicing enhancer) führt und ursächlich für das, vorwiegend vom SMN2-Gen produzierte, alternativ gespleißte SMN2 Transkript (SMN2delta7) ist. Dieses verkürzte SMN2-Protein ist funktionell nicht äquivalent mit dem Volllänge-SMN-Protein und kann somit das Fehlen von SMN1 nicht kompensieren.

Da jeder Patient mindestens eine SMN2-Kopie trägt, haben wir uns gefragt, ob das alternative Spleißen durch Spleißfaktoren reguliert werden könnte. Wir haben den ersten trans-aktivierenden Spleißfaktor, Htra2-beta1, identifiziert, der mit ansteigender Konzentration eine in vivo Umwandlung des SMN2-Spleißmusters in Zellkulturen bewirkt. Dabei entstehen über 80% Volllängetranskripte und weniger als 20% alternativ-gespleißte SMN2-Transkripte. Weitere in vivo Spleißexperimente mit im Exon 7 mutierten Minigenen sowie RNA-Protein- Bindungsexperimente ermöglichten uns, die genaue RNA-Protein-Interaktionsdomäne zu ermitteln. Es handelt sich um eine GA-reiche Domäne mitten im Exon 7. Eine ähnliche Heraufregulierung der vom SMN2-Minigen erzeugten Volllängetranskripte, war sowohl in menschlichen als auch in Mauszellen zu beobachten.

Darüber hinaus ist es uns gelungen, weitere an der Regulation des SMN2 Exon 7 Spleißens beteiligten Proteine - hnRNP-G und RBM- zu identifizieren. HnRNP-G und RBM interagieren unspezifisch mit der SMN-RNA, jedoch spezifisch mit Htra2-beta1 und können durch Überexpression in Zellkultur sowohl das exogen- als auch das endogen-exprimierte SMN-Protein hochregulieren.

Die Aufklärung der molekularen Grundlage der SMA sowie die Identifizierung mehrerer trans-aktivierender Spleißfaktoren, die die Prozessierung der SMN2-RNA verändern können, eröffnen einmalige Chancen hinsichtlich der Entwicklung einer Therapie bei einer genetisch bedingten Erbkrankheit. 

Um das Spektrum, der von Htra2-beta 1 regulierten Gene, zu identifizieren, haben wir konditionale Tra2-beta1 knock-out Mäuse generiert, die zur Zeit charakterisiert werden.